ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ:
ПОСТРОЕНИЕ И ОБРАБОТКА ИЗОБРАЖЕНИЙ
При изучении свойств объектов методами сканирующей зондовой микроскопии основным результатом научного поиска являются, как правило, трехмерные изображения поверхности этих объектов. Адекватность интерпретации изображений зависит от квалификации специалиста. Вместе с тем, при обработке и построении изображений используется ряд традиционных приемов, о которых следует знать при анализе изображений.
Сканирующий зондовый микроскоп появился в момент интенсивного развития компьютерной техники. Поэтому при записи трехмерных изображений в нем были использованы цифровые методы хранения информации, разработанные для компьютеров. Это привело к значительному удобству при анализе и обработке изображений, однако пришлось пожертвовать фотографическим качеством, присущим методам электронной микроскопии.
Информация, полученная с помощью зондового микроскопа, в компьютере представляется в виде двумерной матрицы целых чисел. Каждое число в этой матрице, в зависимости от режима сканирования, может являться значением туннельного тока, или значением отклонения кантилевера, или значением какой-то более сложной функции. Если показать человеку эту матрицу, то никакого связного представления об исследуемой поверхности он получить не сможет. Итак, первая проблема — это преобразовать числа в вид, удобный для восприятия. Делается это следующим образом.
Числа в исходной матрице лежат в некотором диапазоне, есть минимальное и максимальное значения. Этому диапазону целых чисел ставится в соответствие цветовая палитра. Таким образом, каждое значение матрицы отображается в точку определенного цвета на прямоугольном изображении. Строка и столбец, в которых находится это значение, становятся координатами точки. В результате мы получаем картину, на которой, например, высота поверхности передается цветом – как на географической карте. Но на карте обычно используются лишь десятки цветов, а на нашей картине их сотни и тысячи. Для удобства восприятия точки, близкие по высоте, должны передаваться сходными цветами.
Может оказаться, и, как правило, так всегда и бывает, что диапазон исходных значений больше, чем число возможных цветов. В этом случае происходит потеря информации, и увеличение количества цветов не является выходом из положения, так как возможности человеческого глаза ограничены. Требуется дополнительная обработка информации, причем в зависимости от задач обработка должна быть разной. Кому-то необходимо увидеть всю картину целиком, а кто-то хочет рассмотреть детали. Для этого используются разнообразные методы, описанию которых посвящена следующая часть статьи. В качестве примера будут рассматриваться изображения, на которых цветом передается высота точки.
Вычитание среднего наклона
Полученные изображения часто имеют общий наклон, который может появляться по разным причинам. Это может быть реальный наклон поверхности; может быть температурный дрейф, который приводит к смещению образца во время сканирования; может быть нелинейность пьезокерамического манипулятора. Как бы то ни было, это приводит к появлению общего наклона, и на изображении обычно это мешает выявлению структуры объекта. Для того, чтобы этого избежать, из исходной матрицы значений вычитается плоскость среднего наклона. Поясним это одномерным случаем (рис. 1).
 |
| Рис. 1. Вычитание среднего наклона |
В результате получается матрица с меньшим диапазоном значений и мелкие детали отображаются большим количеством цветов, становятся более заметными.Нелинейности пьезоманипулятора могут приводить также к тому, что изображение получается вогнутым. В этом случае нужно вычитать не плоскость, а более сложную поверхность — параболическую или гиперболическую.
Усреднение
Помимо полезного сигнала на изображении всегда присутствует шумовая составляющая. Чтобы убрать ее, часто достаточно заменить значение в каждой точке средним арифметическим значений всех точек в некоторой ближайшей ее окрестности (рис. 2).
Если это не помогает — например, если уровень шумов довольно высок — требуется применение более сложных методов. Например, можно попробовать выделить полезный сигнал, убрав высокочастотную составляющую исходного сигнала. В сущности, усреднение по окрестности и есть такая фильтрация. Часто помогает увеличение размеров окрестности, по которой ведется усреднение. Рассмотрим для примера одномерный случай, т.е. не двумерную матрицу, а строку значений.
 |
| Рис. 2. Усреднение |
Построим график, на котором по горизонтали отложим координату точки, а по вертикали значения точек. В результате получится профиль строки. На рис. 2 изображен этот профиль до и после фильтрации.
Медианная фильтрация
Хорошие результаты дает медианная фильтрация. Это нелинейный метод обработки изображений, позволяющий убрать резкие выбросы, но, в отличие от усреднения, оставляющий ступеньки. Поясним этот метод на одномерном случае. По горизонтали отложена координата точки, по вертикали — значение. Получается двумерный профиль. Для фильтруемой точки берутся значения ее соседей и заносятся в таблицу. Эта таблица сортируется по возрастанию, и за новое значение точки принимается значение из средней ячейки таблицы.
 |
| Рис. 3. Медианная фильтрация |
Таким образом, если в точке был выброс, то она оказывается на краю отсортированной таблицы и не попадает в отфильтрованное изображение. Ступеньки же остаются без изменения (рис. 3). Если сравнить результаты усреднения и медианной фильтрации, то легко заметить различия в конечных результатах (рис. 2,3).
Усреднение по строкам
Изображения в сканирующей зондовой микроскопии характерны тем, что формируются они построчно. Таким образом, появляется выделенное направление (формирования строки), вдоль которого изображение имеет характерные особенности. Дело в том, что снятие строки происходит быстро, а между снятием соседних строк проходит некоторое время. При этом может произойти какой-то сбой, и следующие строки окажутся резко сдвинутыми вверх или вниз. На изображении появляется горизонтальная ступенька, которой нет на реальной поверхности. Чтобы убрать этот дефект, применяется усреднение по строкам. Все строки изображения сдвигаются вверх или вниз так, чтобы их средние значения были одинаковыми. При этом профиль строки остается прежним, а профиль столбца меняется, — убираются ступеньки (рис. 4).
 а |
 б |
Рис. 4. Изображения многокомпонентной органической
пленки
а — до усреднения по строкам;
б — после усредения
Подсветка
Человеческий глаз лучше различает контрастные предметы. Потому на изображении, где цветом передается высота, мелкие детали не заметны на фоне крупных объектов. Как же поступить в этом случае?
Есть способ совместить информацию о высоте объекта с информацией о высоте мелкой детали над его поверхностью. Представьте, что вы летите на самолете над горами Кавказа. Вы ясно различаете все ущелья и утесы, хотя по сравнению с самими горами перепад высот там совсем невелик. Это происходит благодаря игре света и тени. Если солнце в зените, то горизонтальные участки поверхности будут освещены сильнее, чем склоны. По величине тени ваш мозг сам рассчитывает высоту объекта.
Таким образом, если смоделировать на изображении эффект освещения, то проявляются мелкие детали, причем без потери информации о крупных объектах (рис. 5).
 а |
 б |
 в |
Рис. 5. Компьютерная обработка позволяет
повысить контраст изображений
а — исходное изображение;
б, в — изображения с применением боковой подсветки разной интенсивности.
Исследуемый объект – бактерии Escherichia coli (кишечная палочка).
Размер кадра 4,6´ 4,6 мкм2
Современные компьютерные программы предлагают различные дополнительные возможности по обработке и построению изображений, полученных с помощью зондового микроскопа. Перспективными являются те програмы, которые допускают многооконный интерфейс. В этом случае на экране монитора можно видеть одновременно разные изображения или одно и то же изображение на разных стадиях его математической обработки.
Пример рабочего поля программы “ФемтоСкан-001” (Москва, Центр перспективных технологий) представлен на рис. 6. Программа “ФемтоСкан-001” разработана для операционных систем Windows 95 и Windows NT.
 |
Рис. 6. Пример рабочего поля программы “ФемтоСкан-001” |
Многооконный интерфейс и широкий набор специализированных функций позволяют представлять полученные изображения в удобном для восприятия виде.